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活性蛋白試劑盒提取操作步驟
點(diǎn)擊次數(shù):787 更新時(shí)間:2022-04-19

本試劑盒用于從哺乳動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞中提取具有活性的全蛋白, 用含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液

Lysis Buffer 勻漿裂解組織或細(xì)胞,作用溫和,提取過程簡(jiǎn)便。獲得的全蛋白可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶 的活性的測(cè)定的等后續(xù)研究,但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究,因本試劑盒中包括這兩種酶的抑制劑。 應(yīng)用方面:可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶活性測(cè)定等后續(xù)研究。

操作步驟

Ⅰ、實(shí)體組織蛋白的提取

1、在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10 μL 磷酸酶抑制劑,1 μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF,混勻。冰上保存數(shù)分鐘待 用;

2、 每 100mg 固體組織置于培養(yǎng)皿中,手術(shù)剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小塊,加入 0.5~1 mL 冷 Lysis Buffer,玻 璃勻漿器上下手動(dòng)勻漿 15 次,注意低溫操作;

3、取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 預(yù)冷的離心管,離心 10000 轉(zhuǎn)/分,4℃離心 5 min;

4、取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中,即為全蛋白提取物,蛋白定量(Bradford 法、BCA 法);

5、分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融。


Ⅱ、培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取

1、 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,吸去培養(yǎng)基后,加入 10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS 洗兩次,每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液;

2、  懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或用細(xì)胞刮子刮下的貼壁細(xì)胞,將細(xì)胞及培養(yǎng)液移至離心管中,1000 轉(zhuǎn)/分離心 10 min,再用10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS,1000 轉(zhuǎn)/分離心 5 min 洗兩次;

3、 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10μL 磷酸酶抑制劑,1μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF(用戶自配:濃度 100mM, 溶于異丙醇),混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用;

4、 在上述培養(yǎng)板或離心管的細(xì)胞中,加入上述配制好的冷 Lysis Buffer;

5、冷室或冰上操作,貼壁細(xì)胞用細(xì)胞刮子刮下,皆 Lysis Buffer 一同轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中;懸浮培養(yǎng)或裂解前刮下的貼壁細(xì)胞皆 Lysis Buffer 一同轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中;

6、置于 4℃搖床平臺(tái)上,溫和振蕩 15 min;

7、14,000rpm,4℃離心 15min,取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量(Bradford 法、BCA 法);

8、  分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融。

注意事項(xiàng):

所有接觸樣品的用具及試劑均需預(yù)冷。我們?cè)谔崛〉鞍缀?,如有必要,可透析除去表面活性劑?/p>


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